2010 год — Первая синтетическая бактериальная клетка (Крейг Вентер J. Craig Venter Institute).

Проект минимального генома:

Производство синтии является результатом усилий в области синтетической биологии в Институте Крейга Вентера группой из примерно 20 ученых во главе с лауреатом Нобелевской премии Гамильтоном Смитом, включая исследователя ДНК Крейга Вентера и микробиолога Клайда А. Хатчисона III. Общая цель состоит в том, чтобы свести живой организм к его основам и, таким образом, понять, что требуется для создания нового организма с нуля. Первоначальным фокусом была бактерия M. genitalium, облигатный внутриклеточный паразит, геном которого состоит из 482 генов, содержащих 582 970 пар оснований, расположенных на одной кольцевой хромосоме (на момент начала проекта это был самый маленький геном любого известного природного организма, который можно выращивать в свободной культуре). Они использовали транспозонный мутагенез для идентификации генов, которые не были необходимы для роста организма, в результате чего получился минимальный набор из 382 генов. Эта работа была известна как проект «Минимальный геном».

Выбор организма:

Микоплазма.

Mycoplasma — род бактерий класса Mollicutes в отделе Mycoplasmatota (ранее Tenericutes), характеризующийся отсутствием клеточной стенки (что делает его грамотрицательным)

из за паразитического или комменсального образа жизни. В молекулярной биологии род привлек большое внимание, как из-за того, что он является заведомо трудноискоренимым загрязнителем в культурах клеток млекопитающих (он невосприимчив к бета-лактамам и другим антибиотикам), так и из-за его потенциального использования в качестве модельного организма из-за его небольшого размера генома. Выбор рода для проекта Synthia датируется 2000 годом, когда Карл Райх придумал фразу Mycoplasma laboratorium.

Другие организмы с небольшими геномами.

По состоянию на 2005 год Pelagibacter ubique (α-протеобактерия порядка Rickettsiales) имеет самый маленький известный геном (1 308 759 пар оснований) любого свободно живого организма и является одной из самых маленьких известных самовоспроизводящихся клеток. Это, возможно, самая многочисленная бактерия в мире (возможно,10-28 отдельных клеток) и, наряду с другими членами клады SAR11, по оценкам, составляет от четверти до половины всех бактериальных или архейных клеток в океане. Он был идентифицирован в 2002 году с помощью последовательностей рРНК и был полностью секвенирован в 2005 году. Чрезвычайно трудно культивировать вид, который не достигает высокой плотности роста в лабораторной культуре. Несколько недавно обнаруженных видов имеют меньше генов, чем M. genitalium, но не являются свободноживущими: многие важные гены, которые отсутствуют у Hodgkinia cicadicola, Sulcia muelleri, Baumannia cicadellinicola (симбионты цикад) и Carsonella ruddi (симбиот черешковой галлиды,Pachypsylla venusta) может кодироваться в ядре хозяина. Организмом с наименьшим известным набором генов по состоянию на 2013 год является Nasuia deltocephalinicola, облигатный симбионт. У него всего 137 генов и размер генома 112 кб.

Техники:

Для проекта пришлось разработать или адаптировать несколько лабораторных методов, поскольку это требовало синтеза и манипулирования очень большими фрагментами ДНК.

Трансплантация бактериального генома.

В 2007 году команда Вентера сообщила, что им удалось перенести хромосому вида Mycoplasma mycoides в Mycoplasma capricolum путем:

• выделение генома M. mycoides: мягкий лизис клеток, попавших в агар — расплавленный агар, смешанный с клетками и оставленный для образования геля — с последующим гель-электрофорезом импульсного поля и выделением полосы правильного размера (круговая 1,25 Мбит/с);

• создание компетентных клеток-реципиентов M. capricolum: рост в богатых средах с последующим голоданием в бедных средах, где нуклеотидное голодание приводит к ингибированию репликации ДНК и изменению морфологии; и

• полиэтиленгликоль-опосредованная трансформация кольцевой хромосомы в клетки, свободные от ДНК, с последующим отбором.

Термин трансформация используется для обозначения введения вектора в бактериальную клетку (путем электропорации или теплового шока). Здесь трансплантация используется сродни ядерной трансплантации.

Бактериальный хромосомный синтез.

В 2008 году группа Вентера описала создание синтетического генома, копии последовательности M. genitalium G37 L43967, с помощью иерархической стратегии:

• Синтез → 1kbp: Последовательность генома была синтезирована Blue Heron в 1,078 кассетах 1080.н. с перекрытием 80.н. и сайтами рестрикции NotI (неэффективный, но нечастый резак).

• Лигирование → 10kbp: 109 групп серии из 10 последовательных кассет лигировали и клонировали в E. coli на плазмиде, а правильная перестановка проверялась секвенированием.

• Мультиплексная ПЦР → 100 кбит/с: 11 групп серии из 10 последовательных сборок 10 кбит/с (выращенных на дрожжах) объединяли мультиплексной ПЦР с использованием пары праймеров для каждой сборки 10 кбит-с.

• Выделение и рекомбинация → вторичных сборок были выделены, соединены и превращены в сферопласты дрожжей без векторной последовательности (присутствующей в сборке 811-900).

• Геном этого результата 2008 года, M. genitalium JCVI-1.0, опубликован на GenBank как CP001621.1. Его не следует путать с более поздними синтетическими организмами, обозначенными JCVI-syn, на основе M. mycoides. 

Синтетический геном:

В 2010 году Вентер и его коллеги создали штамм Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 с синтетическим геномом. Изначально синтетическая конструкция не работала, поэтому, чтобы точно определить ошибку, которая вызвала задержку всего проекта на 3 месяца, была создана серия полусинтетических конструкций. Причиной сбоя была единичная мутация со сдвигом кадра в ДНКА, фактор инициации репликации.

Цель построения клетки с синтетическим геномом состояла в том, чтобы проверить методологию, как шаг к созданию модифицированных геномов в будущем. Использование естественного генома в качестве шаблона свело к минимуму потенциальные источники неудач. В Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 присутствует несколько различий по сравнению с референтным геномом, в частности, транспозон E.coli IS1 (инфекция со стадии 10kb) и дупликация 85.н., а также элементы, необходимые для размножения в дрожжах, и остатки из сайтов рестрикции.

Были споры о том, является ли JCVI-syn1.0 истинным синтетическим организмом. В то время как геном был синтезирован химически во многих частях, он был сконструирован так, чтобы точно соответствовать родительскому геному, и трансплантирован в цитоплазму естественной клетки. Сама по себе ДНК не может создать жизнеспособную клетку: белки и РНК необходимы для считывания ДНК, а липидные мембраны необходимы для разделения ДНК и цитоплазмы. В JCVI-syn1.0 два вида, используемые в качестве донора и реципиента, принадлежат к одному и тому же роду, что снижает потенциальные проблемы несоответствия между белками в цитоплазме хозяина и новым геномом. Пол Кейм (молекулярный генетик из Университета Северной Аризоны во Флагстаффе) отметил, что «впереди большие проблемы, прежде чем генные инженеры смогут смешивать, сопоставлять и полностью проектировать геном организма с нуля».

Водяные знаки.

Широко разрекламированной особенностью JCVI-syn1.0 является наличие последовательностей водяных знаков. 4 водяных знака (показанные на рисунке S1 в дополнительном материале статьи) представляют собой закодированные сообщения, записанные в ДНК, длиной 1246, 1081, 1109 и 1222 пар оснований соответственно. В этих сообщениях использовался не стандартный генетический код, в котором последовательности из 3 оснований ДНК кодируют аминокислоты, а новый код, изобретенный для этой цели, который читателям было предложено разгадать. Содержание водяных знаков выглядит следующим образом:

1. Водяной знак 1: HTML-скрипт, который считывается в браузере в виде текста, поздравляющего декодера, и инструкций о том, как отправить авторам электронное письмо, чтобы доказать декодирование.
2. Водяной знак 2: список авторов и цитата из Джеймса Джойса: «Жить, ошибаться, падать, торжествовать, воссоздавать жизнь из жизни».
3. Водяной знак 3: больше авторов и цитата Роберта Оппенгеймера (в титрах не указан): «Смотрите на вещи не такими, какие они есть, а такими, какими они могут быть».
4. Водяной знак 4: больше авторов и цитата Ричарда Фейнмана: «То, что я не могу построить, я не могу понять».

JCVI-syn3.0.

В 2016 году Институт Вентера использовал гены JCVI-syn1.0 для синтеза меньшего генома, который они называют JCVI-syn3.0, который содержит 531 560 пар оснований и 473 гена. В 1996 году, после сравнения M. genitalium с другой небольшой бактерией Haemophilus influenza, Аркадий Мушегян и Юджин Кунин предположили, что может существовать общий набор из 256 генов, который может быть минимальным набором генов, необходимых для жизнеспособности. В этом новом организме количество генов может быть сокращено только до 473, 149 из которых имеют функции, которые совершенно неизвестны. По состоянию на 2022 год неизвестный набор был сужен примерно до 100. В 2019 году была опубликована полная вычислительная модель всех путей в клетке Syn3.0, представляющая собой первую полную модель in silico для живого минимального организма. 

Проблемы и противоречия:

Ресепшн.

6 октября 2007 года Крейг Вентер объявил в интервью британской газете The Guardian, что та же команда химически синтезировала модифицированную версию одной хромосомы Mycoplasma genitalium. Синтезированный геном еще не был пересажен в рабочую клетку. На следующий день канадская группа по биоэтике ETC Group опубликовала заявление через своего представителя Пэта Муни, в котором говорилось, что «творение» Вентера было «шасси, на котором можно построить практически все, что угодно. Это может быть вклад в развитие человечества, такой как новые наркотики, или огромная угроза человечеству, такая как биологическое оружие».

Вентер прокомментировал: «Мы имеем дело с большими идеями. Мы пытаемся создать новую систему ценностей для жизни. Имея дело в таком масштабе, вы не можете ожидать, что все будут счастливы».

21 мая 2010 года Science сообщила, что группа Вентера успешно синтезировала геном бактерии Mycoplasma mycoides из компьютерной записи и трансплантировала синтезированный геном в существующую клетку бактерии Mycoplasma capricolum, у которой была удалена ДНК. «Синтетическая» бактерия была жизнеспособной, т.е. способной к репликации. Вентер описал его как «первый вид... чтобы его родители были компьютером». 

О создании новой синтетической бактерии JCVI-3.0 было объявлено в журнале Science 25 марта 2016 года. У него всего 473 гена. Вентер назвал его «первым дизайнерским организмом в истории» и утверждал, что тот факт, что 149 необходимых генов имеют неизвестные функции, означает, что «во всей области биологии отсутствует треть того, что необходимо для жизни».

Освещение в прессе.

Проект получил широкое освещение в прессе из-за зрелищности Вентера, до такой степени, что Джей Кислинг, новаторский синтетический биолог и основатель Amyris, прокомментировал, что «единственное регулирование, которое нам нужно, — это рот моего коллеги». 

Утилита.

Вентер утверждал, что синтетические бактерии являются шагом к созданию организмов для производства водорода и биотоплива, а также для поглощения углекислого газа и других парниковых газов. Джордж М. Черч, еще один пионер в области синтетической биологии, выразил противоположную точку зрения, что создание полностью синтетического генома не является необходимым, поскольку кишечная палочка растет более эффективно, чем M. genitalium, даже со всей ее дополнительной ДНК; Он отметил, что синтетические гены были включены в E.coli для выполнения некоторых из вышеперечисленных задач.

Интеллектуальная собственность.

В 2006 году Институт Крейга Вентера подал патенты на геном Mycoplasma laboratorium («минимальный бактериальный геном») в США и за рубежом. Канадская группа по биоэтике ETC выразила протест на том основании, что патент был слишком широким по объему.

Похожие проекты:

С 2002 по 2010 год команда из Венгерской академии наук создала штамм Escherichia coli под названием MDS42, который в настоящее время продается компанией Scarab Genomics из Мэдисона, штат Висконсин, под названием «Чистый геном». E.coli», где 15% генома родительского штамма (E. coli K-12 MG1655) были удалены, чтобы помочь в эффективности молекулярной биологии, удаляя элементы IS, псевдогены и фаги, что приводит к лучшему поддержанию токсичных генов, кодируемых плазмидой, которые часто инактивируются транспозонами. Биохимия и механизм репликации не были изменены.